文獻(xiàn)背景
纖維化或無序的纖維組織形成，是由異常的成纖維細(xì)胞激活，過度的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑引起，可導(dǎo)致多器官功能障礙。小分子藥物如吡非尼酮和尼達(dá)尼布進(jìn)行抗肝纖維化治療的臨床療法具有適度的療效、有限的適應(yīng)癥和嚴(yán)重的副作用，因此迫切需要針對(duì)纖維化的替代臨床干預(yù)療法。
肌成纖維細(xì)胞的激活和增殖在纖維化形成中具有核心作用，特異性阻斷肌成纖維細(xì)胞的激活是一種很有潛力的療法。TGF-β、IL-11、IL-13和IL-17等細(xì)胞因子已被證明在介導(dǎo)纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然一些抗細(xì)胞因子療法如托珠單抗注射液已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)，取得了良好的臨床效果，但仍有部分患者臨床療效不佳。失敗的主要原因是纖維化疾病涉及多種細(xì)胞因子，單純抑制一種或幾種細(xì)胞因子可能是不夠的，或者靶外抑制這些細(xì)胞因子可能會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。因此下一代治療有望使用局部應(yīng)用的抗細(xì)胞因子策略來靶向整體纖維化微環(huán)境。
基于自體皮膚成纖維細(xì)胞的治療來有效地減弱多器官纖維化。滅活的自體皮膚成纖維細(xì)胞具有完整的膜受體，制備簡便，經(jīng)濟(jì)可行。內(nèi)源性受體可以識(shí)別、隔離和清除某些細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活動(dòng)，但不能觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖1a）。成纖維細(xì)胞膜包裹聚乳酸-乙醇酸（PLGA）納米顆粒（FNPs）來增強(qiáng)穩(wěn)定性和促進(jìn)給藥。體外檢測多種促纖維化細(xì)胞因子與FNPs的競爭結(jié)合，三種不同器官纖維化（肝纖維化、肺纖維化和心臟纖維化）的動(dòng)物模型證實(shí)FNPs在體內(nèi)具有抗纖維化效果，表明其具有良好的臨床潛力（圖1b）。
圖1
基本信息
摘要
纖維化的一個(gè)特征是肌成纖維細(xì)胞的異常激活和積聚，這是由過量的促纖維化細(xì)胞因子引起的。傳統(tǒng)的抗細(xì)胞因子療法因單純阻斷一種或幾種抗纖維化細(xì)胞因子并不能消除促纖維化的微環(huán)境而無法進(jìn)行臨床試驗(yàn)。本文基于自體皮膚成纖維細(xì)胞的仿生納米顆粒來中和多種成纖維細(xì)胞靶向的細(xì)胞因子。將皮膚成纖維細(xì)胞膜融合到聚乳酸-乙醇酸上形成成纖維細(xì)胞膜包裹納米顆粒（FNPs）。FNPs可以有效清除TGF-β、IL-11、IL-13和IL-17等各種促纖維化細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)促纖維化的微環(huán)境。在三種不同器官纖維化（肺纖維化、肝纖維化和心臟纖維化）的動(dòng)物模型中，F(xiàn)NPs可有效減少肌成纖維細(xì)胞的積聚和纖維組織的形成，同時(shí)恢復(fù)器官功能，表明FNPs是一種潛在的治療纖維化的方法。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.FNPs的制備與表征
皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-11RA、IL-13RA、IL-17RA和TGF-β RII等多種細(xì)胞因子受體（圖1c）。FNPs具有球形的核-殼結(jié)構(gòu)，比未包裹的PLGA納米粒子大20 nm（圖1d-f）。FNPs具有與成纖維細(xì)胞囊泡相似的表面電荷，其聚合物分散性指數(shù)（PDI）為0.18（圖1e，g）。與PLGA相比原代心臟成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)FNPs的攝取均顯著降低（圖1h，i）。FNPs含有TGF-β RII、IL-11RA、IL-13RA和IL-17RA多種負(fù)責(zé)細(xì)胞因子結(jié)合的受體，而RNPs作為FNPs的對(duì)照，低表達(dá)或不表達(dá)上述細(xì)胞因子受體，F(xiàn)NPs以劑量依賴的中和這四種細(xì)胞因子（圖1j，k）。
2.FNP抑制TGF-β1-誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化
TGF-β1刺激靜息肺成纖維細(xì)胞表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），形成應(yīng)力纖維（圖2a）。FNPs可明顯改善TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化的刺激效應(yīng)，α-SMA表達(dá)減少和應(yīng)力纖維形成，但RNPs沒有細(xì)胞因子中和作用（圖2a-c）。TGF-β1可增強(qiáng)肺成纖維細(xì)胞的增殖能力、收縮能力和遷移能力，F(xiàn)NPs存在時(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的上述效應(yīng)被顯著抑制，且在RNPs中略強(qiáng)（圖2d-f）。TGF-β1刺激下NMuMG細(xì)胞間黏附連接被破壞，E-鈣粘素表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)增加，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白從皮質(zhì)重排為應(yīng)力纖維分布（圖2g，h）。TGF-β1還增強(qiáng)了ACTA2、Vimentin、Col1a1和MMP9的mRNA的表達(dá)（圖2i）。將FNPs添加到培養(yǎng)基中可以減弱這些影響，而RNPs沒有減弱效果（圖2g-i）。
圖2
3.氣管內(nèi)注射FNPs改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化
小鼠每5天通過微噴霧器氣管內(nèi)吸入FNPs（50 μL，2 mg/mL）、RNPs或PBS溶液，直到觀察結(jié)束（圖3a）。FNP治療顯著延長了小鼠總生存率（FNP：65%，PBS：30%，RNP：35%）（圖3b）。第21天時(shí)，對(duì)照組小鼠有嚴(yán)重的肺損傷和纖維化，而FNP組小鼠的肺損傷和纖維化明顯減弱（圖3c，d）。通過用力肺活量、肺順應(yīng)性、用力呼氣量等監(jiān)測，F(xiàn)NP處理的小鼠的肺功能也得到了保護(hù)（圖3e）。損傷21天后，對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重扭曲，形成蜂窩狀纖維團(tuán)塊，F(xiàn)NP治療有效地減少了纖維化面積，并保留了正常的肺泡結(jié)構(gòu)（圖3f，g）。博萊霉素增加了肺組織中α-SMA和I型膠原的染色，F(xiàn)NP組顯著減少，但RNP組沒有顯著減少（圖3f，h）。FNP組小鼠肺中纖維連接蛋白、I型膠原和α-SMA顯著減少（圖3i，j）。FNP組TGF-β1的水平顯著降低（圖3k，l），F(xiàn)NP可降低FSP-1陽性細(xì)胞百分率和FSP-1/α-SMA雙陽性細(xì)胞百分率（圖3m，n）。
圖3
4.靜脈注射FNPs改善四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化
小鼠注射6周CCl4誘導(dǎo)肝纖維化，每7天接受一次FNPs、RNPs或?qū)φ罩委煟▓D4a）。隨著纖維化的發(fā)展，對(duì)照組肝臟回聲的強(qiáng)度和不均一逐漸增強(qiáng)，在門靜脈區(qū)附近觀察到大范圍的纖維帶，每周靜脈注射FNPs有效地減緩了肝纖維化的進(jìn)展，肝臟回聲減少且更加均勻（圖4b，c）。FNP組的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度降低，F(xiàn)NPs治療顯著減少了纖維化區(qū)域，下調(diào)了α-SMA表達(dá)、I型膠原沉積（圖4d-f）。FNPs可降低促纖維化、促炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)相關(guān)基因的表達(dá)，并恢復(fù)肝臟代謝基因的表達(dá)（圖4g）。FNPs抑制了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，并恢復(fù)了肝臟代謝（包括脂肪酸、膽汁酸、糖原、酪氨酸和藥物代謝）相關(guān)分子數(shù)據(jù)庫（MSigDB）的相關(guān)基因表達(dá)（圖4h，i）。
圖4
5.心肌內(nèi)注射FNP-海藻酸鹽水凝膠減輕局部成纖維細(xì)胞活化和膠原沉積及膠原亞型改變
FNPs與海藻酸鈣懸浮液相互作用形成離子橋制備FNP-海藻酸鹽水凝膠復(fù)合材料（圖5a）。FNPs在藻酸鹽支架中均勻分布，具有比粘性模量（G″）值高約10倍的恒定彈性模量（G′）（圖5b，c）。FNP-AH組G′值隨應(yīng)變?cè)黾佣焖傧陆担哂懈呓Y(jié)合能力，但AH和RNP-AH對(duì)TGF-β1、IL-11、IL-13和IL-17的結(jié)合能力不足（圖5d，e）。急性炎癥中成纖維細(xì)胞增殖并被激活，導(dǎo)致大量α-SMA陽性肌成纖維細(xì)胞在梗塞區(qū)域聚集，但鄰近FNP-AH注射部位的區(qū)域α-SMA陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著減少（圖5f，g）。膠原沉積在鄰近FNP-AH注射部位的區(qū)域也顯著減少（圖5h，i）。FNP-AH組彈性Ⅲ型膠原纖維比剛性I型膠原纖維的百分比更高（圖5j，k）。
圖5
6.FNP-AH復(fù)合材料改善心肌梗死后的心臟功能、減少纖維化面積和限制了心臟重構(gòu)
結(jié)扎前降支冠狀動(dòng)脈誘發(fā)心肌梗死，在缺血區(qū)和邊緣區(qū)多點(diǎn)注射FNP-AH、RNP-AH或AH來誘導(dǎo)MI（圖6a）。FNP-AH可改善心肌梗死組的生存，但AH或RNP-AH不能改善生存（圖6b）。MI后心室損害的改善保持了四周（圖6d）。左心室擴(kuò)張?jiān)贔NP-AH組中也得到顯著預(yù)防，F(xiàn)NP-AH組中心肌細(xì)胞存活率顯著增加（圖6e-g）。FNP-AH組纖維化顯著改善，AH和RNP-AH組也有中度改善，F(xiàn)NP-AH、RNP-AH和AH組的室壁厚度明顯高于MI組（圖6h-j）。與MI組相比FNP-AH組的楊氏模量顯著降低，RNP-AH組和AH組的楊氏模量中度降低（圖6k，l）。FNP-AH組邊緣的心肌細(xì)胞的橫截面積明顯低于其他組（圖6m，n）。
圖6
結(jié)論
該研究開發(fā)了一種基于自體皮膚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)抗纖維化藥物的簡便方法，在細(xì)胞資源、成本和時(shí)間方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。對(duì)MI高風(fēng)險(xiǎn)的患者可以預(yù)先建立細(xì)胞庫來收集皮膚成纖維細(xì)胞，生產(chǎn)足量成纖維細(xì)胞衍生膜用于個(gè)體化FNP治療，來自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞可用于為急性損傷患者制造FNPs。為進(jìn)一步促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化，應(yīng)繼續(xù)研究其在逆轉(zhuǎn)纖維化中的潛在作用，通過遺傳方法擴(kuò)大細(xì)胞膜的中和能力，并在其他纖維化模型中測試其治療效果。
索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)
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