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質(zhì)粒提取常見問題解答

1. QG8140 綠色熒光核酸染料(10000×)  染色,條帶不亮是為什么?

A:綠色熒光核酸染料特別適合于大片段 DNA 的檢測(大于 1kb 的片段,檢測靈敏度與 EB 相當(dāng));當(dāng) DNA 片段小于 1kb ,檢測靈敏度低于 EB,特別是低于 500bp 的片段綠色熒光核酸染料可能亮度很弱或檢測不到.如果檢測小片段的 DNA,請選用G8142,該染色劑適合于檢測所有片段大小的 DNA 片段。

一般的,100mL膠加10微升染料,如果覺得熒光較弱,可適當(dāng)增加染料用量。

 

2. Q:使用G8142 GoldView II 核酸染料 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,膠回收PCR產(chǎn)物時,電泳結(jié)果顯示MARK和目的條帶均不清晰,呈彌散狀,后續(xù)實驗無法進(jìn)行。

A:使用時,請將商品化的 Marker 用 1×DNA Loading Buffer 作 5-10 倍的稀釋,上樣 1-10µl, 以得到較好的結(jié)果(通常稀釋 10 倍后上樣 5ul)。對于待檢測樣品,通常僅需 1-2µl 即可。如果濃度較高,也須作一定倍數(shù)稀釋,否則會造成條帶不整,影響遷移速率。凝膠回收請選擇點染方法。

 

3. Q:提取量不夠?

A:一般的,增加樣本量是Z簡單的方法。此外,吸附膜的主要原理是低溫結(jié)合、高溫洗脫。因此,在吸附柱靜置時,放在結(jié)合3-5min,再重新吸附一次,通過增加結(jié)合次數(shù)達(dá)到提高提取量的目的。如果提取的質(zhì)粒較小或拷貝數(shù)很低,可以在吸附那一步適當(dāng)加入少量的1/5-1/3的異丙醇,提高回收率(一般不建議)

 

4. QD1140 提取量有多少?

A:因質(zhì)??截悢?shù)的差異性,不一定能夠上百。

 

5. Q:有專門用于提取質(zhì)粒的柱子嗎?

AN1010N1011-A都可以

 

6. QN1011-B 可以用于提取質(zhì)粒嗎?

A:不可以。只能用于提取基因組,提取質(zhì)粒會造成質(zhì)粒虛高。

 

7. QN1010 系列的柱子,可以容納多少體積溶液?

A650-700微升左右

 

8. Q提取出的質(zhì)粒用于測序,可以用你們的洗脫緩沖液嗎?

A:可以的,一般情況下影響不大。如果不放心,可以換用無菌ddH2O洗脫。

 

9. Q提取質(zhì)粒后,做轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)不出來?

A:一般優(yōu)先懷疑感受態(tài),若確認(rèn)感受態(tài)沒問題,再檢測是否用錯抗生素或是操作中有問題。如果確認(rèn)是質(zhì)粒的原因,可加大轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的用量(一般的,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化僅需1微升左右(質(zhì)粒濃度在500ng/ul左右),若質(zhì)粒濃度很低(小于100ng/ul),可以將質(zhì)粒用量提高至10微升)

10. Q提取出的質(zhì)粒,PCR沒有條帶?

A1.檢驗引物是否適用;2.檢驗程序是否合適;3.檢驗自己操作過程中是否有問題;4.質(zhì)粒濃度不可太高(一般PCR的質(zhì)粒濃度在50-100ng/ul之間)

 

11. Q:轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是,可以加抗生素嗎?

A:可以的,不會影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。

 

12. Q:沒有提出任何質(zhì)粒?

A:1.菌體老化(重新轉(zhuǎn)化或活化菌株)?2.裂解不充分;3.菌體中真的無質(zhì)粒;4.檢查試劑盒中的試劑有無出現(xiàn)沉淀;5.加洗脫液時,沒有加到吸附膜上或加的體積太少

 

13. Q:提出的質(zhì)粒PCR、酶切鑒定中有一個有問題,能用嗎?

A:不能。

 

14. QP3110 pET-28a+) 跑膠檢測 質(zhì)粒大小和說明書上大小不一致。

A:如果想要跑膠檢測質(zhì)粒大小,需要先將質(zhì)粒進(jìn)行單酶切,將質(zhì)粒變?yōu)榫€性的再進(jìn)行跑膠鑒定。超螺旋或是開環(huán)狀態(tài)的質(zhì)粒都無法表示質(zhì)粒的大小。如果客戶不認(rèn)可單酶切結(jié)果,可以直接測序檢測。

 

15. QR1030 RNase A溶液(10mg/ml ) 使用RNase A從大腸桿菌中提質(zhì)粒,質(zhì)粒溶液中的 RNA沒有去掉。

ARNase A溶液 工作濃度是200ug/ml  ;而客戶這邊10ug/ml  建議增大用量。

 

16. Q:質(zhì)粒沒有被內(nèi)切酶切割?

A1.酶活低,可以延長時間或是用量;2.質(zhì)粒和酶活不匹配,優(yōu)化酶切條件;3.質(zhì)粒不純,含有SDS,酚,EDTA等內(nèi)切酶抑制因子;4.質(zhì)粒上的酶切位點突變了;5. DNA不存在該酶識別順序;6.buffer和酶不匹配

 

17. Q16.質(zhì)粒酶切不全?

A1.酶活低,可以延長時間或是用量;2.質(zhì)粒和酶活不匹配,優(yōu)化酶切條件;3.沒有混勻酶切體系;4.buffer和酶不匹配

 

18. QDNA片段數(shù)目多于理倫值?

A1.內(nèi)切酶星狀活性;2.其它內(nèi)切酶污染:換一支新的酶或buffer3;底物中含其它DNA雜質(zhì):重新提質(zhì)粒

 

19. Q:跑膠檢驗時,條帶拖尾,模糊?

A1.濃度過高;2.鹽離子高;3.有蛋白污染;4.降解了;5.換新的電泳液

 

20. Q4.Q:那個柱子可以用于膠回收?(質(zhì)粒提取、膠回收、基因組、PAGE凝膠回收的試劑盒中的柱子)

A: N1030 離心式過濾柱,主要用于過濾碎膠等較大的雜質(zhì)

   N1010/N1012/N1011-A 可用于膠回收(質(zhì)粒、片段等)

   N1011-B  主要用于提基因組,不用于提質(zhì)粒(會虛高)

 

21. Q:質(zhì)粒提取類試劑盒中,所有的酶都是單發(fā)的嗎?

A:是的。因為一般都要-20保存。所以不放在試劑盒里。以附件形式單發(fā)(冰盒/冰袋)

 

22. QSN0020 細(xì)胞核提取試劑盒  小鼠肝臟組織,勻漿后離不下去。

A:加熱一下,讓溶液不要那么粘稠。

 


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