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蛋白marker發(fā)展史

蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),常稱之為蛋白Marker。在免疫印跡(Western blot)試驗(yàn)中,分子量Marker雖不起眼,但意義重大,是陽性對(duì)照,是大小的標(biāo)準(zhǔn),是必須的。只有Marker精確無誤了,實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說服力。除此之外,蛋白Marker還能夠提示電泳是否正常,轉(zhuǎn)移是否成功等信息。 
光陰似箭,日月如梭,不知不覺中蛋白Marker經(jīng)歷了普通Marker、預(yù)染Marker和曝光Marker三個(gè)發(fā)展階段。

1.0代產(chǎn)品:普通蛋白Marker
普通蛋白Marker,或稱之為未染色蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),也叫預(yù)混(pre mixed)蛋白分子量Marker,是簡單,也是最準(zhǔn)確的一種。由于沒有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子,所示大小正好是蛋白原本的大小,是早期精確判斷蛋白大小的產(chǎn)品。普通Marker多數(shù)都選用預(yù)混和的Marker,方便不同大小的蛋白比較。預(yù)混的Marker通常有一個(gè)或者幾個(gè)條帶加倍濃度作為區(qū)別,用于幫助判斷每個(gè)條帶的大小。在選擇上來說,當(dāng)然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的,越近越好。普通Marker不如預(yù)染Marker好用,因?yàn)殡娪具^程中看不到,要和目標(biāo)蛋白一起等到最后染色才能見真容,無法對(duì)實(shí)驗(yàn)過程起預(yù)示參照作用。屬于“后知后覺"型的,當(dāng)然還是比“不知不覺"不做對(duì)照的要好。按照條帶的分子量大小通常有三種:寬分子量蛋白Marker、高分子量蛋白Marker、低分子量蛋白Marker。
從實(shí)驗(yàn)總體考慮的,應(yīng)該選范圍盡量寬,條帶分布比較均勻的,這樣你的蛋白無論在哪個(gè)區(qū)間都容易判斷,避免正好落在一段空白區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)。不過,條帶越多,價(jià)格可能也會(huì)越貴。如果買的是大包裝,就應(yīng)該考慮分裝。要考慮到反復(fù)凍融對(duì)蛋白的傷害,不能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)虐我,我就虐蛋白吧。另外要知道,寬譜的Marker不一定每條都能看到的,特別是Mini Cell。還有,如果側(cè)重大蛋白,那小的可能就已經(jīng)跑掉了,跟質(zhì)量無關(guān)。
在一般的蛋白電泳當(dāng)中,低分子量Marker(PR1400)使用較多,除了有指示蛋白大小的作用以外,有時(shí)還可以用作粗略的定量。還有一類特別小的蛋白Marker,比如用于30kD以下蛋白或者多肽的。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白Marker挺不錯(cuò),另外提醒一句,特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色漂亮,上樣量一定要足夠。 

2.0代產(chǎn)品:預(yù)染蛋白Marker
預(yù)染蛋白分子量(prestained Marker),也叫預(yù)染Marker,是將Marker的蛋白,通過與染料共價(jià)耦聯(lián),在電泳過程中或者轉(zhuǎn)膜時(shí)可以肉眼直接觀察到的一種蛋白分子量Marker。預(yù)染Marker帶來了很多方便,可以幫助我們?cè)陔娪緯r(shí)、電泳后,以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測電泳情況和估計(jì)遷移率。比如,已知垂直電泳最佳分辨區(qū)域大約在膠的2/3處,如果使用預(yù)染Marker就可以預(yù)測目標(biāo)蛋白進(jìn)入最佳分辨區(qū)時(shí)停止電泳以得到最佳分辨效果;如果觀察到Marker電泳異常也可以及時(shí)終止電泳。另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否完成。Marker和染料一同轉(zhuǎn)移到膜上,可以方便的用來對(duì)照顯色后的目標(biāo)蛋白大小。預(yù)染Marker有這么多優(yōu)點(diǎn),所以現(xiàn)在應(yīng)用的很多。值得注意的是,預(yù)染蛋白Marker與染料共價(jià)耦聯(lián),在不同的緩沖條件下電泳時(shí)遷移特性可能會(huì)發(fā)生某些變化,可能會(huì)導(dǎo)致一些偏差,所以不太適合精確定位蛋白。如果拋開分子量的偏差,預(yù)染Marker還是很好用的,也可以和普通Marker一起使用,做精確對(duì)比。 預(yù)染Marker可以分為兩種:單色預(yù)染和多色預(yù)染(又稱為彩虹Marker)。單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的,觀察起來不是很方便。彩虹Marker(PR1910),比較容易區(qū)分條帶的大小。還有一點(diǎn)特別要注意,由于轉(zhuǎn)膜是一個(gè)將膠里的Marker轉(zhuǎn)印膜上,所以需要的上樣量相對(duì)少一些。如果想要在電泳過程中看到美麗的“彩虹"或者漂亮的單色Marker,往往需要比說明書里多加一些Marker的。省錢與美麗,背道而馳。

2.5代產(chǎn)品:間接曝光Marker
普通Marker和預(yù)染Marker還有一個(gè)缺點(diǎn)就是不能夠在最終Western曝光的膠片或者掃描照片中顯色,最終判斷Western結(jié)果,還需要將照片和膜進(jìn)行比對(duì),容易出現(xiàn)偏差或者錯(cuò)誤。很多產(chǎn)品在向最終的顯色做努力,Biorad的Precision Plus Protein WesternC 就是其中的一例。該產(chǎn)品的所有條帶都含有 Strep-標(biāo)簽,當(dāng)使用 StrepTactin-HRP時(shí)可被化學(xué)發(fā)光檢測最終顯示在凝膠轉(zhuǎn)印膜膠片或 CCD 圖像中。這個(gè)好像有些復(fù)雜,需要輔助另外的產(chǎn)品,或者多余的步驟,我們就把該類產(chǎn)品定義為蛋白Marker的第2.5代產(chǎn)品,或者叫做的蛋白Marker 2S吧(apple手機(jī)的命名規(guī)則)。

3.0代產(chǎn)品:曝光Marker
說了這么多,大家也明白了蛋白Marker的第三代產(chǎn)品是什么樣子的。3.0版本的蛋白Marker,就是最終的Marker條帶會(huì)和檢測目標(biāo)蛋白會(huì)一同出現(xiàn)在顯色的圖片中,我們又稱之為曝光Marker(Exposure Marker)。曝光Marker的原理是,每個(gè)條帶蛋白都含有IgG結(jié)合位點(diǎn),可以與人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊以及兔子來源的IgG恒定區(qū)結(jié)合,因此在實(shí)驗(yàn)過程中這些蛋白可以直接或間接地結(jié)合二抗,與實(shí)驗(yàn)樣品信號(hào)同時(shí)在X膠片上曝光顯色。由此可以更方便準(zhǔn)確地判斷實(shí)驗(yàn)樣品信號(hào)的位置和大小。
曝光Marker克服了使用常規(guī)預(yù)染 Marker評(píng)估蛋白轉(zhuǎn)膜效率和樣品抗原信號(hào)時(shí)所存在的一些不足。這些不足主要表現(xiàn)為:1、預(yù)染marker經(jīng)過化學(xué)修飾后分子量與SDS-PAGE上表現(xiàn)的遷移率不一致;2、預(yù)染marker無法在X光膠片上顯色,X光膠片上顯色的條帶需要與轉(zhuǎn)移到膜上的預(yù)染 Marker比對(duì)才能確認(rèn)蛋白的位置和大小,整個(gè)過程比較繁瑣同時(shí)容易造成誤差甚至是錯(cuò)誤。3、也是最重要的一點(diǎn),目的條帶和曝光Marker出現(xiàn)在同一圖片中,而不是后期的拼接,這樣的結(jié)果更讓別人信賴。現(xiàn)在很多大文章都在使用曝光Marker,可以預(yù)見,以后文獻(xiàn)上逐漸都會(huì)使用曝光Marker。

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