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Omega-質(zhì)粒提取試劑盒

操作步驟： 

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。溶液YP1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式

離心機在室溫下離心。 

1、取1-5ml酵母培養(yǎng)物（不超過 5×107cells），12000rpm離心 1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。 

2、酵母細胞壁的破除： 

A、酶法：向酵母菌體中加入 470ul 山梨醇 Buffer，充分懸浮菌體，加入 25ul 酵母破壁酶和 5ul β-巰基乙醇，充分混勻，30℃處理 1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm 離心 1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入 250ul 溶液 YP1（請先檢查是否已加入 RNaseA） ，充分懸浮沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導致質(zhì)粒提取量和純度偏低。 

B、玻璃珠法：向酵母菌體中加入 250ul 溶液 YP1（請先檢查是否已加入 RNaseA） ，充分懸浮沉淀。加入 150-200ul酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩 10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請用溶液 YP1 補足 250ul）于另一干凈離心管中。 

3、向離心管中加入 250ul溶液 YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以

免污染細菌基因組 DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。 

4、向離心管中加入 350ul溶液 YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心 10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液 YP3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。 

5、將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱重新放回收集管中。 

6、向吸附柱中加入 700ul 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 

7、向吸附柱中加入 500ul漂洗液，12000rpm離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 

8、12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR 等。 

9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經(jīng) 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 2min，12000rpm離心 1min。 

10、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min， 12000rpm離心 1min。  

注意事項： 

1、使用前請先檢查溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。 

2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)此范圍)，pH 值低于 7.0 會降低。洗脫效率；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA降解。 

3、質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)粒拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)?？截悢?shù)都很低，一般通過電泳或分光光度計法都很難檢測到，可通過 PCR或轉(zhuǎn)化大腸桿菌來檢測。 

4、DNA濃度及純度檢測：得到的基因組DN**段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。回收得到的DN**段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰， OD260值為 1 相當于大約 50  μg/ml雙鏈DNA、40  μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。 

Omega-質(zhì)粒提取試劑盒