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雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 分子生物學

雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒( Dual-Lucy Assay Kit )
貨號：D0010
規(guī)格：100T
保存：低溫運輸，冰袋運輸。-20℃保存 12 個月。長期保存推薦 -80℃。
產(chǎn)品內(nèi)容：
組分編號 名稱 100 次 1000 次
A 細胞裂解液 60 mL 60 mL×10
B 螢火蟲熒光素酶緩沖液 10 mL 10 mL×10
C 螢火蟲熒光素酶底物（50 X） 200 µL 200 µL×10
D 海腎熒光素酶緩沖液 10 mL 10 mL×10
E 海腎熒光素酶底物（50 X） 200 µL 200 µL×10
注意：螢火蟲熒光素酶反應工作液和海腎熒光素酶反應工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
產(chǎn)品說明：
螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）大小為61 KDa，單亞基蛋白，能夠催化熒光素（luciferin）氧化，生成氧化熒光素oxyluciferin；海腎熒光素酶（Renilla luciferase）為36 KDa的單亞基蛋白，能夠催化腔腸素（coelenterazine）氧化形成coelenteramide。二者在翻譯后均無需修飾即可發(fā)揮作用。
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒先以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶報告基因的活性，之后在淬滅該熒光反應的同時，以腔腸素為底物檢測海腎熒光素酶報告基因的活性。其檢測機理機理如圖所示：

螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的發(fā)光波長為560 nm。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光
的發(fā)光波長為465 nm。
通常將目的基因的5´UTR或者啟動子克隆Firefly Luciferase的上游，或者3´UTR克隆FireflyLuciferase的下游，通過檢測螢火蟲熒光素酶的量來檢測啟動子或者調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。RenillaLuciferase作為內(nèi)參，來消除細胞數(shù)量或者轉(zhuǎn)染效率的差異。

實驗步驟
1：裂解細胞
1）將細胞裂解液充分混勻，按如下方式加入細胞裂解液，充分裂解細胞。
a: 對于貼壁細胞，吸盡細胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂解液*覆蓋細胞；
b: 對于懸浮細胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液，細胞培養(yǎng)板 96 孔板 48 孔板 24 孔板 12 孔板 6 孔板裂解液加入量 100 µL 150 µL 200 µL 300 µL 500 µL
2）冰上孵育 5 min，充分裂解細胞。
3）（選作）10000-16000rpm 離心 1 min，取上清。
2：熒光檢測
1）取20 µL 細胞裂解液，加黑色酶標板中。按照實驗需要，可設置 3 孔-5 孔重復。
2）配制螢火蟲熒光素酶反應工作液和海腎熒光素酶反應液，即螢火蟲熒光素酶底物（50 X）和海腎熒光素酶底物（50 X） 分別用對應的緩沖液稀釋 1 X 工作液。并孵育室溫。
3）加入 100 µL 螢火蟲熒光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力，檢測盡量在 30 min 內(nèi)完成。
4）加入 100 µL 海腎熒光素酶反應液，震板混勻，檢測海腎熒光素酶的活力，檢測盡量在 30 min 內(nèi)完成。
5）分析數(shù)據(jù)。

相關(guān)文獻：

《Long non-coding RNA MBNL1-AS1 regulates proliferation, migration, and invasion of cancer stem cells in colon cancer by interacting with MYL9 via sponging microRNA-412-3p》 作者:Kongxi Zhu，Yunxia Wang，Lan Liu，Shuai Li，Weihua Yu 期刊:Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology 影響因子:2.807 PMID:31255531
《Effects of Srxn1 on growth and Notch signalling of astrocyte induced by hydrogen peroxide》 作者:Lan Li, Guangjun Lin, Huizi Gu, Lei Yu & Changwei Ni 期刊:Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology 影響因子:4.462 PMID:31079497
 

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