產(chǎn)品名稱:丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒
產(chǎn)品型號:BC0545
產(chǎn)品特點:丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒測定意義:PK(EC 2.7.1.40)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,催化糖酵解過程中的后一步反應(yīng),是糖酵解過程中的主要限速酶之一,也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一,因此測定PK活性具有重要意義。測定原理:PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+,在340nm下測定NADH下降速率
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丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒
操作步驟:
一、樣本的前處理
1、細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(10 4個)提取液體積(mL)為 500-1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或者 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5-10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿;8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
二、測定步驟及加樣表:
1. 分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長 340nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 樣本測定
(1) 在試劑二瓶中加入 17ml 試劑一和 1ml 蒸餾水充分溶解,置于 37℃(哺乳動物)或 25℃ (其他物種)水浴 5 分鐘,現(xiàn)配現(xiàn)用。
(2) 在試劑三中加入 1ml 蒸餾水充分溶解,冰上放置備用,現(xiàn)配現(xiàn)用。
(3) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑三和 180μL 試劑二,混勻,立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,計算△A=A1-A2.
PK 活性計算: A.用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
1、 血清(漿)PK 活力的計算:單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/mL)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷V 樣÷T=1608×△A
2、 組織、細菌或細胞中 PK 活力的計算:
(1) 按樣本蛋白濃度計算:單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/mg prot)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=1608×△A ÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算單位的定義:每 g 組織每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/g 鮮重)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×△A ÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/10 4 cell)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.216×△A V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4L;ε:NADPH 摩爾消光系數(shù),6.22×10 3L/mol/cm;d:比色皿光徑, 1 cm;V 樣:加入樣本體積,0.01mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。
B.用 96 孔板測定的計算公式如下:
1、 血清(漿)PK 活力的計算:單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/mL)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷V 樣÷T=3216×△A 2、 組織、細菌或細胞中 PK 活力的計算:
(1) 按樣本蛋白濃度計算:單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/mg prot)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=3216×△A ÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算單位的定義:每 g 組織每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/g 鮮重)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=3216×△A ÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK(U/10 4 cell)=[△A×V 反總÷(ε×d)×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.432×△A V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4L;ε:NADPH 摩爾消光系數(shù),6.22×10 3L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,2min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。
相關(guān)文獻:
《Galangin and Pinocembrin from Propolis Ameliorate Insulin Resistance in HepG2 Cells via Regulating Akt/mTOR Signaling》 作者:Yinkang Liu, Xiali Liang,Gensheng Zhang,Lingjie Kong,Wenjun Peng and Hongcheng Zhang 期刊:Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 影響因子:1.984 PMID:30420897
丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;試劑一:液體 20 mL×1 瓶,4℃保存;試劑二:粉劑×1 支,-20℃保存;試劑三:液體×1 支,4℃保存;
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