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堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)

自備材料：
1、載玻片、濕盒
2、普通光學(xué)顯微鏡
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
       堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，簡(jiǎn)稱(chēng) ALP 或 AKP)為一類(lèi)磷酸酯酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組
織內(nèi)，其活性所需適 pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物質(zhì)交換活躍之處(細(xì)胞膜)，如腸上皮和腎近曲小管的刷狀緣、附睪上皮之靜纖毛、肝的毛細(xì)膽管膜以及微動(dòng)脈和毛細(xì)血管動(dòng)脈部之內(nèi)皮，還見(jiàn)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、吞飲小泡、腸上皮之溶酶體、中性粒細(xì)胞之中性顆粒以及平滑肌之細(xì)胞膜。不是采用金屬沉淀法來(lái)顯示堿性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶聯(lián)法(又稱(chēng)同時(shí)偶聯(lián)法)，其原理是在 pH9.2～9.8 的堿性條件下，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶可使 AB-BI 磷酸鹽水解，釋放出磷酸與萘酚，后者與偶聯(lián)重氮鹽生成有色產(chǎn)物，定位于細(xì)胞質(zhì)中。該染液可用于血液、骨髓或細(xì)胞涂片、冰凍切片、梯度入水后的石蠟切片等的堿性磷酸酶染色，堿性磷酸酶活性部位呈藍(lán)色，位于胞槳，結(jié)果較金屬鹽沉淀法可靠。

操作步驟：
一、涂片或切片
1、 血液、骨髓或細(xì)胞涂片、冰凍切片、石蠟切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蠟切片無(wú)需固定)，水洗。
2、 滴加配制好的 ALP 孵育液，放入濕盒中，避光孵育 15～20min，水洗。
3、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染 3～5min。
4、 水洗、鏡檢或甘油明膠封固后鏡檢。
二、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1、 取6孔板或其他容器培養(yǎng)的細(xì)胞，棄液，PBS清洗干凈。
2、 加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。
3、 滴加配制好的 ALP 孵育液，放入濕盒中，避光孵育 15～20min，PBS 清洗。
4、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染 3～5min。
5、 PBS 清洗、鏡檢。

染色結(jié)果：
ALP 活性部位 藍(lán)色
細(xì)胞核 紅色(核固紅)或綠色(甲基綠)
血液、骨髓涂片結(jié)果判斷：
一般以積分報(bào)告結(jié)果，根據(jù) 100 個(gè)中性粒細(xì)胞陽(yáng)性顆粒進(jìn)行 0-4 計(jì)分。
細(xì)胞分值 染色特點(diǎn)
0 無(wú)顆粒
1 稍有顆粒
2 中等程度顆粒
3 多數(shù)顆粒
4 充滿(mǎn)顆粒

注意事項(xiàng)：
1. 血液或骨髓細(xì)胞涂片或其他樣本均應(yīng)新鮮，薄厚適宜，及時(shí)固定，否則會(huì)影響酶的活性。
2. 培養(yǎng)細(xì)胞染色操作過(guò)程中，清洗、染色等步驟都應(yīng)輕微，以免損傷或丟失細(xì)胞。
3. ALP 孵育液易失效或降低陽(yáng)性強(qiáng)度，即配即用，不宜久置。
4. 復(fù)染時(shí)，核固紅染色液或甲基綠染色液二者取其一。
5. 每次染色時(shí)，應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照片。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Hedgehog pathway inhibition causes primary follicle atresia and decreases female germline stem cell proliferation capacity or stemness》 作者:Yu Jiang, Dantian Zhu, Wenfeng Liu, Qiushi Qin, Zhi Fang and Zezheng Pan 期刊:Stem Cell Research & Therapy 影響因子:4.627 PMID:31277696

堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)