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小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒
貨號(hào) ：P8860
規(guī)格 ：200ml
保存 ：室溫避光儲(chǔ)存，有效期少 2 年。

試劑盒內(nèi)容 ：

全血及組織稀釋液 200ml
細(xì)胞洗滌液 200ml
試劑C 200ml
試劑F 200ml
說明書 1 份

脾臟組織單細(xì)胞懸液的制備方法
注 ：A ．全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 。
B ．本試劑盒中不包含膠原酶，若采用酶消化法制備單細(xì)胞懸液 ， 請(qǐng)客戶根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室要求另購不同類型膠原酶 。
     1. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量F液及20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪勻漿狀，加入5mlF液及20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾到試管內(nèi)；離心沉淀1500轉(zhuǎn)/分×3min，再用細(xì)胞洗滌液清洗3次，每次以500rpm短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以200目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×10 7 個(gè)/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液備用。
     2. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入70ml組織研磨器內(nèi)，加入2mlF液及20%胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨勻漿；用5mlF液及20%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，經(jīng)200目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；
離心沉淀800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液洗3次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×10 7個(gè)/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液備用。
    3. 酶消化法：
     A．用F液將膠原酶稀釋，終濃度為400 U/ml，于冰浴備用。
     B．取一適當(dāng)大小培養(yǎng)皿進(jìn)行操作：用鑷子夾碎動(dòng)物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，37℃消化20分鐘。
     C．以100或200目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾，離心沉淀800prm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液洗3次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5×10 7 個(gè)/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液備用。
 

細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:
    細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。
    不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。
    計(jì)數(shù)與計(jì)算過程
    1）在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。
    2）用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，蓋玻片被液體充滿為止。
    3）置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。
    4）按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度： 細(xì)胞密度＝（4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×10 4 個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)公式中乘以10 4 因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm 3 而 1ml＝1000mm 3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：
    A．進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10 4 個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200個(gè)/10mm 2 或>500個(gè)/10 mm 2 時(shí)，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。
   B．要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
   C． 取樣計(jì)數(shù)前， 應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液， 尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻， 以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；
   D．?dāng)?shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。
   E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。
? 脾臟淋巴細(xì)胞分離方法
   1．取1ml脾臟細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個(gè)/ml）小心疊加在C 液之液面上（比例為1：1），20℃±2℃，400g（約1500 轉(zhuǎn)/分），離心20 分鐘（半徑15cm 水平轉(zhuǎn)子）。
   2. 此時(shí)離心管中由上下細(xì)胞分四層。*層;為稀釋液層。第二層；為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含細(xì)胞洗滌液4-5 毫升的試管中，充分混勻后，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘。沉淀經(jīng)反復(fù)洗滌2 次即得所需淋巴細(xì)胞。
注： 提取率約為80%。

分離圖例：

三 、  注意事項(xiàng)
     A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過程中應(yīng)在18℃-25℃避光保存，啟封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
     B． 待分離的骨髓要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴箱中復(fù)溫20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果好，且所有操作過程一定要在無菌條件下進(jìn)行。
     C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索佳的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）。
     D． 好使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

四 、 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下

五 、 貯藏及保存期限
     18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，有效期一周。
     注：若保證無微生物污染，啟封后可置4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒

參考文獻(xiàn)：
《Tumor-Repopulating Cells Induce PD-1 Expression in CD8+ T Cells by Transferring Kynurenine and AhR Activation》 作者:Yuying Liu,Xiaoyu Liang,Wenqian Dong,Yi Fang,Jiadi Lv,Tianzhen Zhang,Roland Fiskesund,Jing Xie,Jinyan Liu,Xiaonan Yin,Xun Jin,Degao Chen,Ke Tang,Jingwei Ma,Huafeng Zhang,JingYu,Jun Yan,Huaping Liang 期刊:Cancer cell  影響因子:23.916 PMID:29533786
《Improved Antitumor Efficacy of Combined Vaccine Based on the Induced HUVECs and DC-CT26 Against Colorectal Carcinoma》 作者:Qiushuang Zhang 1,?, Chao Xie 1,?, Dongyu Wang 1, Yi Yang 1, Hangfan Liu 1, Kangdong Liu 1,2, Jimin Zhao 1,2, Xinhuan Chen 1,2, Xiaoyan Zhang 1,2, Wanjing Yang 1,2, Xiang Li 1,2, Fang Tian 1,2, Ziming Dong 1,2 and Jing Lu  期刊:Cells 影響因子:5.656 PMID:31121964
《Protective Role of Peroxiredoxin I in Heat-Killed Staphylococcus Aureus-infected Mice》 作者:HU-NAN SUN,YUE LIU1,JIAN-NAN WANG, CHUANG WANG, REN LIU, LING-ZU KONG, XING ZHEN, NISANSALA CHANDIMALI, YU-DONG CUI, SUN-UK KIM, DONG-SEOK LEE, DAE-YEUL YU, JI-SU KIM, DONG KEE JEONG, TAEHO KWON6 and YING-HAO HAN1 期刊:In Vivo 影響因子:1.609 PMID:31028193
《Artificially designed hepatitis B virus core particles composed of multiple epitopes of type A and O foot‐and‐mouth disease virus as a bivalent vaccine candidate》 作者:Yao Lei, Junjun Shao,  Furong Zhao,  Yangfan Li , Chenglin Lei , Feifei Ma , Huiyun Chang , Yongguang Zhang 期刊:J. Med. Virol. 影響因子:2.049 PMID:31347713