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活性氧檢測試劑盒的操作步驟
  活性氧檢測試劑盒操作步驟:
  一、裝載探針:
  對于刺激時間較短(通常為2 小時以內)的細胞,先裝載探針,后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6 小時以上)的細胞,先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞,后裝載探針。
  原位裝載探針:本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1 ∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μ mol/L。去除細胞培養(yǎng)液,加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜,通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 分鐘。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0~30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
  收集細胞后裝載探針:按照1 ∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細胞濃度為一百萬二千萬/mL ,37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20分鐘。每隔3 ~5 分鐘顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞,或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0~30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
  說明:僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照,其余孔不必加入Rosup。
  二、檢測:
  對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測,也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
  三、參數(shù)設置
  使用488nm 激發(fā)波長,525nm 發(fā)射波長,實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF 的熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數(shù)設置檢測DCF 。

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