葡聚糖凝膠指的是由一定平均相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖(dextran) 和甘油基以醚橋形式相互交聯(lián)而成,具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),應(yīng)用面廣的一類凝膠,國(guó)外商品名為Sephadex。交聯(lián)度的大小,可通過控制交聯(lián)劑(一般為環(huán)氧氯丙烷) 和葡聚糖的配比以及反應(yīng)條件來控制。
方法分類:
1.乙醇浸泡:在室溫下,將干粉浸泡于50-60%乙醇中少24小時(shí),并不斷攪拌以保證凝膠溶脹,用無鹽水洗去殘存的乙醇濾干;
2.無鹽水浸泡:室溫下,在無鹽水中充分溶脹24小時(shí),間隙攪拌,以保證凝膠的*溶脹,然后;
3.鹽酸浸泡:在常溫下再用0.2NHCl浸泡12小時(shí),間隙攪拌,濾干,水洗中性;
4.將溶脹好的凝膠脫氣后(真空抽濾或超聲波)根據(jù)裝柱要求一次性置入柱內(nèi),注意保持濕態(tài)裝柱,并避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或斷層;
5.上樣前平衡層析柱少3-5個(gè)柱體積直到記錄儀基線變得平穩(wěn)為止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值);
6.凝膠過濾的上樣量一般為5%的柱床體積,我們建議初次上樣控制在1-2%的床體積,視分離情況可以調(diào)整;脫鹽時(shí)上樣量可以達(dá)到20%的柱床體積,柱高的選擇也與分離要求相關(guān),柱高控制在40-50cm以下,過高的凝膠層會(huì)引起較大的反壓,應(yīng)當(dāng)盡可能避免。難分離物質(zhì)要有一定柱高和流速控制,脫鹽時(shí)高徑比為5:1即可;
7.洗脫方法:可以用無鹽水,也可以采用上柱時(shí)的緩沖液洗脫;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脫或鹽梯度洗脫也可以*分離純化;
8.在位清洗(CIP)凝膠使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床內(nèi)沉淀的及頑固殘留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氫氧化鈉反向洗四個(gè)柱體積,再以少三個(gè)柱體積平衡緩沖液再生。