品牌:Solarbio | 貨號:CA1030|規(guī)格:25T/50T/100T|保存:2-8度避光保存,勿冰凍。
英文名稱 | Annexin V PE/7-AAD |
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別名 | 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 |
產(chǎn)品簡介:
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使 PS 暴露在細(xì)胞膜外表面。PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS 暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性,對 PS 有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此,可以采用 AnnexinV 與7-AAD 雙染的方法,通過流式檢測細(xì)胞早期凋亡。
操作步驟:
1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備: a)對于貼壁細(xì)胞:小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞,細(xì)胞可以被輕輕 用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下所有的貼壁細(xì)胞,并輕輕吹散細(xì)胞。再次 收集到離心管內(nèi)。1000rpm 左右離心 5min,沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法*離心離心管底, 可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細(xì)胞。加入約 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清; b)對于懸浮細(xì)胞:1000rpm 左右離心 5min,沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法*離心離心 管底,可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液,以避免 吸走細(xì)胞。加入約 1ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清;
2、用去離子水按 1:3 稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4x 結(jié)合緩沖液+12ml 去離子水);
3、用 1x 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為 1-5×106 /ml;
4、取 100µl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中,加入 5µlAnnexin V/PE 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘;
5、加入 10µl 20ug/ml 的 7AAD,并加 400µl PBS,立刻進(jìn)行流式檢測。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
1)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 空白管:陰性對照組細(xì)胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于調(diào)節(jié)電壓; 單染管:陽性對照組細(xì)胞,只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償; 檢測管:處理的細(xì)胞,加 Annexin V/PE,7AAD。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后,獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
2)轉(zhuǎn)染 GFP 未轉(zhuǎn)染空白管:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于調(diào)節(jié)電壓; 未轉(zhuǎn)染單染管:未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞,只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償; 轉(zhuǎn)染 GFP 空白管:轉(zhuǎn)染 GFP 對照組細(xì)胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償 檢測管:處理的細(xì)胞,加 Annexin V/PE,7AAD。調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后,獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
注意事項(xiàng):
1、Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和,而 PS 在不同種屬間沒差異。在正常細(xì)胞中,PS 只分布在細(xì)胞膜脂 質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,PS 由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè);
2、低濃度胰酶消化,輕柔吹打貼壁細(xì)胞 2~3 次,離心機(jī) 4℃1000rpm 5min 離心,處理得當(dāng)?shù)脑?,胰酶造成損 傷可以控制在 5%以內(nèi),有對照組的情況下對實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會造成明顯影響。
3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷,而且 PI 本身對細(xì)胞也是有毒性的,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會比胰 酶大,不建議這樣做;
4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白,所以不能加入 EDTA,防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V,進(jìn)而影 響結(jié)果。
5、用流式檢測凋亡時,PI 受時間的影響很大,因標(biāo)記了 PI 后會加大細(xì)胞毒性,隨著時間延長會導(dǎo)致 PI 的染 色增加,特別是檢測早期凋亡時,如果時間延長除了會導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外,誤差會明顯 加大。一般 PI 加上后立刻上機(jī),然后在一個小時內(nèi)檢測完成。兩種方法都可以,但是按照我們操作步驟造成 的誤差會更小。
相關(guān)產(chǎn)品:
CA1050 AnnexinV-Alexa Fluor647/PI 凋亡流式檢測試劑盒
CA1040 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Kit 凋亡流式檢測試劑盒
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