亚洲视频一区二区二区,欧美日韩国产综合片区,国产精品老熟女露脸视频,亚洲免费不卡一区二区三区

1.DNA八面體線框的分層自組裝

作者首先獲得了單鏈CA4-FS，接下來(lái)通過(guò)分層自組裝策略構(gòu)建了一個(gè)DNA八面體。采用可編程退火的方法，構(gòu)建了6個(gè)四通連接DNA塊作為DNA八面體的頂點(diǎn)。然后DNA塊通過(guò)它們的單鏈結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成一個(gè)DNA八面體線框。優(yōu)化了構(gòu)建條件后，驗(yàn)證了由DNA塊逐步組裝的DNA八面體（圖1a）。AFM成像證實(shí)了八面體的形態(tài)（圖1b）。為了證明藥物負(fù)載的可調(diào)性，作者構(gòu)建了具有不同手柄數(shù)的DNA八面體用于與CA4-FS雜交。

這種DNA八面體的可尋址性和可預(yù)見(jiàn)性允許地裝載不同數(shù)量的單鏈CA4-FS。作為概念驗(yàn)證，作者構(gòu)建了半負(fù)載CA4-八面體（hCA4-Oct）和全負(fù)載CA4-Oct，并測(cè)定了負(fù)載效率（圖1c）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證hCA4-Oct和CA4-Oct的可編程組裝，作者接下來(lái)分別用Cy3標(biāo)記的Oct-12H、Cy3標(biāo)記的Oct-24H和Cy5標(biāo)記的CA4-FS研究了CA4-Oct的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，hCA4-Oct和CA4-Oct均顯示出明顯的FRET信號(hào)。八面體水動(dòng)力尺寸為17.0±1.1nm，功能Oct-12H和Oct-24H的水動(dòng)力尺寸分別為24.9±3.0和26.5±3.4nm。hCA4-Oct的大小為29.5±3.2nm，CA4-Oct的大小為30.1±3.7nm（圖1d）。AFM成像也證實(shí)了hCA4-Oct和CA4-Oct的形成。這一結(jié)果表明CA4-FS指向DNA八面體核的外側(cè)，形成三層核-殼納米組裝體。上述結(jié)果證明了在DNA八面體上可以地裝載多個(gè)游離藥物分子。

2.細(xì)胞內(nèi)化與腫瘤球體穿透

為了大限度地負(fù)載CA4-FS，接下來(lái)的研究選擇了一個(gè)*負(fù)載CA4修飾的DNA八面體。圖2a，b結(jié)果證明了通過(guò)修飾DNA納米結(jié)構(gòu)上的適配體增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)化。競(jìng)爭(zhēng)性阻斷實(shí)驗(yàn)也支持了這一結(jié)論。CA4-Oct的位移大于CA4-FS?；谏鲜鼋Y(jié)果，作者推斷，內(nèi)化增強(qiáng)的因素有：（i）識(shí)別單元增加（24 CA4-FS vs 1 CA4-FS）；（ii）八面體結(jié)構(gòu)的剛度；（iii）提高CA4-Oct的穩(wěn)定性。對(duì)于穩(wěn)定性因子的重要作用，作者測(cè)試了CA4-Oct和CA4-FS在10%胎牛血清中的生物穩(wěn)定性。8小時(shí)處理后，CA4-Oct保持不變，但55%的CA4-FS被降解。所以CA4-Oct的內(nèi)化速率比CA4-FS的內(nèi)化速率要快（圖2b）。CA4-Oct和CA4-FS在無(wú)FBS培養(yǎng)基中保持了相同的完整性，表現(xiàn)出了相同的時(shí)間依賴性內(nèi)化速率，進(jìn)一步說(shuō)明了至關(guān)重要的穩(wěn)定因子減緩了CA4-FS的時(shí)間依賴性內(nèi)化。

為了研究細(xì)胞選擇性，作者還檢測(cè)了PTK7陰性的NCM460細(xì)胞（正常結(jié)直腸細(xì)胞系）。與NCM460細(xì)胞相比，CA4-Oct和CA4-FS對(duì)HCT116細(xì)胞的吸收更多（圖2c）。值得注意的是，與單鏈CA4-FS相比，CA4-Oct對(duì)HCT116細(xì)胞和NCM460細(xì)胞間CA4傳遞的細(xì)胞內(nèi)化選擇性要大得多（圖2d）?？梢暬簿劢钩上褚沧C實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明CA4-Oct比單鏈CA4-FS具有更多的細(xì)胞內(nèi)化和選擇性。為研究CA4在實(shí)體腫瘤組織中的遞送深度，制備HCT116三維多細(xì)胞腫瘤球形體。與單鏈CA4-FS相比，CA4-Oct在腫瘤球狀體中心有更高的強(qiáng)度（圖2e）。這些發(fā)現(xiàn)支持了適配體殼由于其識(shí)別和結(jié)合作用而起主導(dǎo)作用的假說(shuō)，以及DNA八面體核促進(jìn)CA4-FS在腫瘤組織中的插入。

3.靶向性細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性

在鑒定了CA4-Oct的細(xì)胞內(nèi)化和穿透能力后，作者測(cè)定了其對(duì)目標(biāo)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。為了研究適配體介導(dǎo)的靶向給藥的影響，作者選擇了8h的短期孵育和40h的額外孵育，將抗癌功能從非特異性細(xì)胞吸附和核溶解中分離出來(lái)。作者發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組Sgc8c、Lib、CA4-Lib、DNA八面體和CA4-Lib-Oct對(duì)HCT116細(xì)胞沒(méi)有或可忽略的細(xì)胞毒性（圖3a）。正如預(yù)期的那樣，CA4-Oct比CA4-FS對(duì)HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出更高的抑制細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)CA4-Oct的細(xì)胞特異性毒性，作者還比較了對(duì)HCT116和NCM460細(xì)胞的毒性。如圖3a所示，在孵育48小時(shí)后（預(yù)處理8小時(shí)后洗），除CA4外，所有組對(duì)NCM460細(xì)胞都沒(méi)有表現(xiàn)出或可以忽略不計(jì)的細(xì)胞毒性?；谶@些結(jié)果，CA4-Oct通過(guò)包裹CA4-FS表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，從而表現(xiàn)出選擇性細(xì)胞毒性。

接下來(lái)，作者將培養(yǎng)時(shí)間增加到48小時(shí)，以評(píng)估DNA序列潛在的不穩(wěn)定性介導(dǎo)的降解所導(dǎo)致的脫靶風(fēng)險(xiǎn)的可能性。基于圖3a研究結(jié)果，作者認(rèn)為顯著提高CA4-Oct的核酸酶抗性可以顯著緩解單價(jià)CA4-FS的脫靶效應(yīng)，從而獲得更好的安全性。

為了進(jìn)一步系統(tǒng)地揭示CA4-Oct的靶向細(xì)胞毒性，作者構(gòu)建了細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬藥物對(duì)體內(nèi)多細(xì)胞共存環(huán)境的現(xiàn)實(shí)影響。在本研究中分別用CA4-Oct或CA4-FS處理轉(zhuǎn)染了GFP的HCT116（GFP陽(yáng)性）和NCM460（GFP陰性）的共培養(yǎng)體系（1:1，Q3/Q4，圖3b）。在未經(jīng)任何處理的孵育4h后，由于癌細(xì)胞的惡性增殖，活癌細(xì)胞與正常活細(xì)胞的比率（RCN）約為2:1（圖3c）。短期治療（8h沖洗后），CA4-Oct組RCN變?yōu)?:4，CA4-FS組RCN僅為1:2（圖3d，e）。除抑制增殖外，CA4-Oct殺死約60%的HCT116細(xì)胞，而CA4-FS僅殺死45%（(Q2/（Q2+Q3)，圖3d，e）。同時(shí)，CA4-FS和CA4-Oct導(dǎo)致正常細(xì)胞凋亡率較低（Q1/(Q1+Q4)，圖3d，e）。在長(zhǎng)期治療（不洗滌）中，CA4-FS殺死了52%的NCM460細(xì)胞，盡管它誘導(dǎo)了71%的HCT116細(xì)胞凋亡（圖3g）。然而，CA4-Oct也能殺死71%的HCT116細(xì)胞，但僅能引起28%的NCM460細(xì)胞凋亡（圖3f）。因此，CA4-FS和CA4-Oct的RCNs分別約為1:3和1:5。顯然，由于細(xì)胞外血清穩(wěn)定性的差異，CA4-FS的脫靶不良反應(yīng)比CA4-Oct嚴(yán)重的多。這些結(jié)果表明，DNA八面體增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的靶向細(xì)胞毒性，降低了正常細(xì)胞的不穩(wěn)定性介導(dǎo)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

4.活體成像分析

在良好的體外表現(xiàn)的鼓舞下，作者實(shí)施了體內(nèi)評(píng)估。首先，將Cy5標(biāo)記的CA4-Oct、Cy5標(biāo)記的CA4-FS和游離的Cy5分別靜脈注射到SD大鼠，通過(guò)追蹤眼眶靜脈血熒光信號(hào)來(lái)評(píng)價(jià)它們的藥代動(dòng)力學(xué)。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持Cy5在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)超出說(shuō)明以外的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，攜帶CA4的CA4-Oct比單鏈CA4-FS的血液濃度和循環(huán)時(shí)間要高得多。

CA4-FS組在注射后4和8小時(shí)腫瘤部位顯示出更亮的Cy5信號(hào)，但在注射后12小時(shí)顯示出非常微弱的熒光信號(hào)（圖4a）。但CA4-Oct組在注射后第1天熒光信號(hào)仍然很亮。同時(shí)處死小鼠進(jìn)行離體分析，評(píng)價(jià)其生物分布。靜脈給藥后12h，Cy5和CA4-FS主要分布在腎臟，而CA4-Oct在腫瘤部位表現(xiàn)出超過(guò)24h的強(qiáng)烈熒光信號(hào)（圖4b）。

為了進(jìn)一步確定CA4-Oct在實(shí)體瘤組織中是否具有*的聚集能力和穿透能力，作者收集CA4-Oct組和CA4-FS組的腫瘤組織進(jìn)行切片分析。CA4-Oct組在各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的Cy5信號(hào)均比CA4-FS組更亮（圖4c，d），說(shuō)明CA4-Oct具有更強(qiáng)的聚集能力，能夠?qū)⒏嗟腃A4藥物傳遞到腫瘤組織。從CA4-FS與FITC標(biāo)記的血管生物標(biāo)志物CD31共定位結(jié)果來(lái)看，CA4-FS大多數(shù)分布在腫瘤血管內(nèi)部或周圍（圖4d）。相比之下，大多數(shù)CA4-Oct穿過(guò)腫瘤血管，到達(dá)腫瘤組織（圖4c），這將有利于深部給藥。多價(jià)、致密、剛性的CA4-Oct確實(shí)增強(qiáng)了單鏈CA4-FS的穿透能力及其在實(shí)體腫瘤組織中的治療潛力。

5.體內(nèi)靶向癌癥治療

圖像表征完成后，作者在HCT116荷瘤異種移植小鼠中進(jìn)行了抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象。經(jīng)5次靜脈給藥（接種腫瘤后第18天），CA4-Oct、CA4-FS、CA4組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到86%、65%、46%（圖5a）。但一旦停止給藥，CA4-Oct的抑瘤率仍維持在85%左右，而CA4-FS組和CA4組的抑瘤率進(jìn)一步下降，分別降至54%和30%（第32天）。這可能是由于CA4-Oct滲透深度較深，滯留時(shí)間較長(zhǎng)所致。此外，體外腫瘤重量和腫瘤圖像均表明CA4-Oct是作為靶向藥物的選擇（圖5b，c）。為了評(píng)估治療的安全性，作者首先監(jiān)測(cè)了這些小鼠的體重變化。由于全身分布的副作用，CA4處理的小鼠體重明顯減輕（約7%）（圖5d）。與CA4-Oct組相比，CA4-FS組體重增長(zhǎng)也下降了6%。第32天取臟器稱重，評(píng)價(jià)藥物對(duì)健康組織的可能損傷。與PBS組和CA4-Oct組相比，CA4和CA4-FS組肝臟異常增重更為嚴(yán)重（圖5e）。對(duì)這個(gè)解毒器官的損害可能是歸因于CA4-FS的脫靶毒性和CA4的非選擇性毒性。為了進(jìn)一步闡明CA4-Oct治療的有效性和安全性，作者采集腫瘤組織、主要臟器和血液進(jìn)行更詳細(xì)的研究。CA4-Oct顯示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（TUNEL+）有約65%的凋亡，而CA4-FS和CA4僅顯示35%和20%的殺傷能力（圖5f）。與CA4-FS組和CA4組相比，增殖標(biāo)記Ki67信號(hào)顯示CA4-Oct對(duì)腫瘤增殖的抑制作用（圖5g）。

接下來(lái)作者也采集了相同條件下未接種腫瘤的正常小鼠的正常器官和血液。首先，作者研究了可能的肝毒性，因?yàn)镃A4可以引起肝痛。與未接種腫瘤的正常組相比，PBS組肝內(nèi)淋巴細(xì)胞輕微浸潤(rùn)，但給藥CA4-Oct減輕了這種趨勢(shì)（圖5h）。PBS和CA4-Oct均未顯示明顯的肝細(xì)胞死亡。CA4-FS組肝細(xì)胞局部壞死，肝星狀細(xì)胞增生。在小鼠肝臟中央靜脈周圍觀察到局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5h）。更嚴(yán)重的是CA4給藥后肝細(xì)胞大面積斑片狀壞死，HSCs增生更為明顯。CA4組可見(jiàn)許多中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶異常升高也證實(shí)了這一趨勢(shì)。這些結(jié)果顯示CA4-FS和CA4的肝毒性水平不同，而CA4-Oct顯示出一定的潛在安全性。

然后作者評(píng)估各組腎臟的HE染色切片的組織病理學(xué)。與正常組比較，PBS組與CA4-Oct無(wú)明顯差異（圖5i）。然而，CA4-FS給藥后，可以看到腎小管刷狀緣局灶性脫落和輕微的細(xì)胞腫脹。在游離CA4組中，除了明顯的細(xì)胞脫落和腫脹外，還發(fā)現(xiàn)血清肌酐明顯升高，間質(zhì)水腫伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5i）。這些結(jié)果表明，適配體修飾緩解了CA4的腎臟損傷，而DNA八面體保護(hù)CA4-FS免于靶CA4外溢至腎臟組織。

作者繼續(xù)檢查其他的生化和血液學(xué)數(shù)據(jù)。與正常組和PBS組比較，CA4-Oct組CK無(wú)明顯升高，而CA4-FS組和CA4組CK有不同程度升高。說(shuō)明CA4-FS和CA4可造成不同程度的心臟損傷。也有報(bào)道稱游離CA4可引起血小板減少癥。CA4確實(shí)導(dǎo)致血小板明顯減少，但CA4-FS和CA4-Oct組未見(jiàn)損傷。另一個(gè)不一致的指標(biāo)是白細(xì)胞（WBCs）的數(shù)量。令人驚訝的是，與正常組相比，CA4-Oct組的WBCs沒(méi)有明顯升高，而PBS、CA4-FS和CA4組的WBCs明顯升高。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步說(shuō)明PBS、CA4-FS和CA4可能導(dǎo)致潛在的炎癥和骨髓抑制。只有CA4-Oct的抗癌方案可以獲得有效的治療，且具有足夠的生物安全性。不幸的是，作者并沒(méi)有從心臟、肝臟和脾臟的HE切片評(píng)估中發(fā)現(xiàn)CA4-Oct的其他優(yōu)勢(shì)。此外，除CA4外，其他各組均未誘導(dǎo)免疫反應(yīng)指標(biāo)明顯升高。