產(chǎn)品貨號(hào):M8650 產(chǎn)品規(guī)格:100T 產(chǎn)品內(nèi)容: 保存條件: -20 ℃避光保存,盡量避免反復(fù)凍融,有效期一年。 超純水和 JC-1 染色緩沖液(5 ×)也可 4 ℃保存。 產(chǎn)品簡(jiǎn)介: 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1 )是一種以 JC-1 為熒光探針,快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒,可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 JC-1 是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位 Ψm △ 的理想熒光探針??梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí) JC-1 為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。 線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò) JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降,同時(shí)也可以用 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。 JC-1 單體的大激發(fā)波長(zhǎng)為 515nm ,大發(fā)射波長(zhǎng)為 529nm ;JC-1 聚合物的大激發(fā)波長(zhǎng)為 585nm ,大發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm 。實(shí)際觀察時(shí),使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。 本試劑盒提供了 CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于六孔板中的樣品,本試劑盒共可 以檢測(cè) 100 個(gè)樣品;對(duì)于 12 孔中的樣品,本試劑盒共可以檢測(cè) 200 個(gè)樣品。 操作步驟: :: : 1、 、、 、JC-1 染色工作液的配制: :: : 六孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為 1mL ,其他培養(yǎng)器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推; 對(duì)于細(xì)胞懸液每 50~100 萬(wàn)細(xì)胞需 0.5mL JC-1 染色工作液。取適量 JC-1 (200×), 按照每 50µL JC-1 (200 ×)加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-1 。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1 。然后再加入 2mL JC-1 染色緩沖 液(5 ×),混勻后即為 JC-1 染色工作液。 2、 、、 、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置 陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置: :: : 把試劑盒中提供的 CCCP(10mM )推薦按照 1 1000 ∶ 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,稀釋 10µM ,處理 細(xì)胞 20 分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-1 ,進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞,通常 10µM CCCP 處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會(huì)*喪失, JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光;而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-1 染色后 應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞,CCCP 的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同,需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資 料決定。 3、 、、 、對(duì)于懸浮細(xì)胞 對(duì)于懸浮細(xì)胞: :: : (1)取 10~60 萬(wàn)細(xì)胞,重懸于 0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中,細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。 (2)加入 0.5mL JC-1 染色工作液,顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 20 分鐘。 (3)在孵育期間,按照每 1mL JC-1 染色緩沖液(5×)加入 4mL 蒸餾水的比例,配制適量的 JC-1 染色 緩沖液(1×),并放置于冰浴。 (4)37℃孵育結(jié)束后,600g 4 ℃離心 3 ~4 分鐘,沉淀細(xì)胞。棄上清,注意盡量不要吸除細(xì)胞。 (5)用 JC-1 染色緩沖液 (1×)洗滌 2 次:加入 1mL JC-1 染色緩沖液 (1×)重懸細(xì)胞, 600g 4 ℃離心 3~ 4 分鐘,沉淀細(xì)胞,棄上清。再加入 1mL JC-1 染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞,600g 4 ℃離心 3~4 分鐘, 沉淀細(xì)胞,棄上清。 (6)再用適量 JC-1 染色緩沖液(1×)重懸后,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,也可以用熒光分 光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。 4、 、、 、對(duì)于貼壁細(xì)胞 對(duì)于貼壁細(xì)胞: :: : 注意:對(duì)于貼壁細(xì)胞,如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè),可以先收集細(xì)胞,重懸后參 考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。 (1)對(duì)于六孔板的一個(gè)孔,吸除培養(yǎng)液,根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一 次,加入 1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。 (2)加入 1mL JC-1 染色工作液,充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。 (3)在孵育期間,按照每 1mL JC-1 染色緩沖液(5×)加入 4mL 蒸餾水的比例,配制適量的 JC-1 染色 緩沖液(1×),并放置于冰浴。 (4)37℃孵育結(jié)束后,吸除上清,用 JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌 2 次。 (5)加入 2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。 (6)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。 5、 、、 、對(duì)于純化的線粒體 對(duì)于純化的線粒體: :: : (1)把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩沖液(1×)稀釋 5 倍。 (2)0.9mL 5 倍稀釋的 JC-1 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10 ~100 µg 純化的線粒體。 (3)用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè):混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描(time scan ),激 發(fā)波長(zhǎng)為 485nm ,發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm 。如果使用熒光酶標(biāo)儀,激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為 485nm 時(shí),可以在 475~520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。另外,也可以參考下面步驟 6 中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè)。 (4)用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察:方法同下面的步驟 6 。 6、 、、 、熒光觀測(cè)和結(jié)果分析 熒光觀測(cè)和結(jié)果分析: :: : 檢測(cè) JC-1 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm ,發(fā)射光設(shè)置為 530nm ;檢測(cè) JC-1 聚合物時(shí),可以 把激發(fā)光設(shè)置為 525nm ,發(fā)射光設(shè)置為 590nm 。 注意:此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在大激發(fā)波長(zhǎng)和大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微 鏡觀察,檢測(cè) JC-1 單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置,如觀察 GFP 或 FITC 時(shí)的設(shè)置;檢測(cè) JC-1 聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光,如碘化丙啶或 Cy3 時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降, 并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常,細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。 注意事項(xiàng): :: : 1. JC-1 (200×)在 4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi),可以 20~25℃ 水浴溫育片刻全部融解后使用。 2. 必須先把 JC-1(200×)用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后,才可以加入 JC-1 染色緩沖液(5×)。 不可先配制 JC-1 染色緩沖液(1×)再加入 JC-1(200×),這樣 JC-1 會(huì)很難充分溶解,會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的 檢測(cè)。 3. 裝載完 JC-1 后用 JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌時(shí),使 JC-1 染色緩沖液(1×)保持 4 ℃左右,此時(shí)的洗 滌效果較好。 4. JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。 5. 請(qǐng)勿把 JC-1 染色緩沖液(5×)全部配制成 JC-1 染色緩沖液(1×),本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用 JC-1 染色緩沖液(5×)。 6. 如果發(fā)現(xiàn) JC-1 染色緩沖液(5×)中有沉淀,必須全部溶解后才能使用,為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。 7. CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑,有毒,請(qǐng)注意小心防護(hù)。
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